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 直销人   2022-08-03 03:17   0 条评论
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原标题:干货收藏版 | 细胞转染实验效率低如何破?

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细胞转染效率低如何破?

细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低却是实验同事们经常遇到的问题,尤其是原代细胞转染,更是因为难度大,号称谁碰谁死,而令人谈虎色变。不,应该是谈原代细胞色变。

当实验进行到转染这一步时有哪些坑要避免?需要注意的因素有哪些呢?

1.细胞系的选择:

细胞系选择有时是实验的需要,有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞,通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法;而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素,姑且不论。不过因为受限于特定的细胞,如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法,照做可也。如果是个新来的细胞株,最好查查资料看哪些成功转染案例。

2. 预实验准备充足

我们做脂质体转染的时候,在开展正式实验前要多做预试验,优化转染条件。优化转染条件包括:脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间等等。

3.电转染电压控制

做电转的时候,如果电压太大,往往会发生细胞大量死亡的情况。不同的细胞,需要的电压是不一样的。这就要求我们多做预实验,多摸索条件。对于大多数细胞来说,其最佳电压位于250-1250v/cm。另外,就是进行转染的细胞应该处于对数生长期。处于对数生长期的细胞的抗损伤能力是最强的。细胞浓度应该处于5x106到1x107/mL之间。每次转染的质粒应该控制在4-6 μg,如果﹥10μg,转染效率也大大降低。电击后,应该将DNA和细胞混合液在室温下放置10分钟,使细胞恢复损伤。

4.试剂品质选择

有时候转染效率低下,还要考虑会不会存在试剂过期的情况。毛博当年做转染整整半年,百思不得其解。最后发现,原来是Lipofectamine 2000过期了。换了之后,立马成功。根据经验,尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000,因为过了半年后,就算没有过失效期,但是细胞毒性大大增加,而转染效率却大大下降。千万不要为了省钱,影响实验进度哈。

5.血清培养很重要

转染后未及时加入血清,会导致细胞大量死亡。一般要在转染后的4-6小时换液且换为有血清的培养基。根据毛博的经验,其实也可以在原来的无血清培养基里面滴加血清。这个时候,最好不要换液,不要打扰细胞,让它安安静静地休息。但是也不能过早加入血清。过早的话,会引起未转染的细胞疯狂生长。那么,什么是最佳时机呢?在20%的细胞变圆的时候,就是加血清的最佳时机。不过要特别注意:对于RNA转染,如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。

6. 防止细胞污染

细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因。首先,转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。业内有个一个独门绝招:将提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样就除菌了。

7.质粒数量保证

转染用的质粒首先要保证数量,一般为2 μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质,也会影响转染效率。这个时候,就应该对质粒进行纯化和浓缩。

8.注意细节

在转染之前更换一次37℃预温的培养基,可提高转染效率。脂质体和DNA/RNA混合物应当一滴一滴地滴下来,从培养皿一边滴到另一边,边滴边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。这些都是一些细枝末节,但是如果不注意的话,也会造成转染效率低下。

9.细胞状态良好

转染前细胞最好经过1—2次传代,以保证细胞生长旺盛,容易转染。注意,贴壁细胞生长到几乎满片时就要赶快进行下一次传代,千万不要使细胞保持融合超过24小时,因为一旦长满了,细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。

大多数已建立的细胞系都是非整倍体,细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化,这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化,融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如,新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率(融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率)。因此,如果观察到转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

10. 恰到好处的铺板密度:

转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低,乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂,最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法,包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%,但这个需要参考所选转染试剂的说明书——阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数,有的要求细胞90%汇片;而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间,总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染,以求最佳的转染效果。

不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度,比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因,就需要较低的铺板密度,所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂需要特别注意。

11. 温暖舒适的培养基

健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性,需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。

12.抗生素的控制

支原体、细菌、真菌污染,无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”,可能会严重影响转染结果,细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素,就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡,造成转染效率低。所以整个过程都不要用抗生素。

END

本文转自Cellmax俱乐部

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