经验分享:注意!质粒中的内毒素,或可影响细胞转染效率!

 直销人   2022-08-05 03:20   0 条评论
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原标题:经验分享:注意!质粒中的内毒素,或可影响细胞转染效率!

转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法中脂质体转染方法较为常用;生物介导方法现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

什么是内毒素?

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(LipopolySaccharide,LPS)和蛋白的复合物,当细菌裂解时便会大量释放出来。内毒素单位为EU。

内毒素对试验的影响

内毒素存在极大程度地影响转染效率。同时内毒素还可能激活免疫细胞的非特异反应,造成实验中的假阳性。因此,为了保证高转染率和转染细胞高存活率,必须从质粒制备的过程中将内毒素去除。

内毒素和质粒的关系

由于内毒素两亲性和负电荷性,性质类似于DNA,因此在质粒纯化中会伴随质粒一同被纯化出来。质粒中内毒素含量的高低常用EU/µg质粒表示。

按照EU/µg大小,质粒被分为三个级别:测序级别( 50EU/µg)、转染级别( 50EU/µg)和无内毒素级别( 0.1EU/µg)。

再次强调

当你提取的质粒DNA是为了转染原代细胞、悬浮细胞或者敏感细胞;进行基因沉默研究、细胞注射显微操作;进行基因治疗或者DNA疫苗等要求极为严格的实验,就应该考虑Endotoxin-Free的质粒。

2017年3月,张锋课题组在《Nature Protocols》发表的《Genome-scaleCRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening》中,Endotoxin-Free的质粒获得被列为 Critical Step,同时推荐该厂家的NucleoBond Endotoxin Free Plasmid DNA kit,可避免病毒包装和细胞培养过程中减少了内毒素残留的影响。

NucleoBond Endotoxin Free Plasmid DNA kit

来自有着近百年滤纸技术和近60年色谱技术的德国MN(MACHEREY-NAGEL)。采用阴离子交换树脂技术作为质粒纯化的原理。

推荐原因:

内毒素低于0.05EU/ug

Endotoxin-Free系列设计有**的Endo-EF内毒素去除试剂,有效去除内毒素,避免了长时间的氯化铯超速离心步骤,也不需要冰上孵育30min,内毒素含量远远低于市面上同类产品。

得率高

采用MAE作为阴离子交换树脂填料,与传统的DEAE材料(二乙氨乙基)相比,亲水性质的羟基(-OH)替代了疏水性质的甲基(-CH3),更小的分子量可以使每克树脂可结合更多的质粒DNA,得率可达1000μg。

DEAE: Diethylaminoethyl(二乙氨乙基)

MAE: Methylaminoethanol(甲基乙醇胺)

超螺旋结构保护好

滤纸和色谱技术相结合诞生的NucleoBond Xtra Column实现裂解液重力过滤和过柱,无需离心,减少了离心力对质粒超螺旋结构的影响。

裂解后的质粒状态(泳道1)和洗脱下来的质粒状态(泳道4)是保持一致的。

抽提速度更快

NucleoBond Xtra Column实现过滤和质粒结合树脂的步骤合二为一,避免较长时间的离心。NucleoBond Finalizer实现过柱后的溶液通过一个针管过滤器,质粒就可以吸附在过滤器中的介质上,仅需要5min即可以完成之前长达1h的异丙醇质粒离心沉淀操作!

来源基因科技有限公司返回搜狐,查看更多

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